細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)

1. 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無菌室及無菌操作臺(tái)(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 %ethanol 擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘后，才開始實(shí)驗(yàn)操作。每次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無菌操作臺(tái)運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘以上后，再進(jìn)行下一個(gè)細(xì)胞株之操作。

2. 無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實(shí)驗(yàn)用品以70 % ethanol 擦拭后才帶入無菌操作臺(tái)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。

3. 小心取用無菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45° 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。

4. 工作人員應(yīng)注意自身之安全，須穿戴實(shí)驗(yàn)衣及手套后才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)于來自人類或是病毒感染之細(xì)胞株應(yīng)特別小心操作，并選擇適當(dāng)?shù)燃?jí)之無菌操作臺(tái)(至少Class II)。操作過程中，應(yīng)避免引起aerosol 之產(chǎn)生，，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳針頭之傷害等。

5. 定期檢測(cè)下列項(xiàng)目：5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力5.2. CO2 培養(yǎng)箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)。5.3. 無菌操作臺(tái)內(nèi)之a(chǎn)irflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預(yù)濾網(wǎng)(300小時(shí)/預(yù)濾網(wǎng)，3000 小時(shí)/HEPA)。

6. 水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750)，定期更換水槽的水

現(xiàn)在做細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室越來越多，如果打算開展或者已經(jīng)開展的單位或者實(shí)驗(yàn)室更要做到以下幾點(diǎn)。

 

1、選擇正確的培養(yǎng)基

在養(yǎng)細(xì)胞之前，就要了解，你所養(yǎng)細(xì)胞的來源以及種類和名稱，查閱一定量的文獻(xiàn)，確定所需培養(yǎng)液種類以及是否需要添加特殊成分，常用的細(xì)胞培養(yǎng)液有DMEM、RPMI1640、F12等等，一些常見的細(xì)胞基本可以使用這幾種培養(yǎng)基中的一種來培養(yǎng)，有的需要加入一定其他成分，這需要根據(jù)不同的細(xì)胞類型，查ATCC細(xì)胞庫或者查文獻(xiàn)，才能找到所需最佳培養(yǎng)液。選擇正確的培養(yǎng)液是養(yǎng)好細(xì)胞的第一步。

2、了解細(xì)胞的生長(zhǎng)習(xí)性

不同的細(xì)胞生長(zhǎng)習(xí)性不同。如成纖維細(xì)胞是貼壁生長(zhǎng)，有一定的密度依賴性，密度小可能會(huì)出現(xiàn)不增殖，狀態(tài)差的情況，接種密度大時(shí)則需要隔天傳代，頻繁傳代則影響細(xì)胞狀態(tài)；再如RPMI-8226人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞，是懸浮生長(zhǎng)的，傳代需離心棄去上清即可。總之，了解細(xì)胞生長(zhǎng)習(xí)性，再加上正確的計(jì)數(shù)，才能掌握好傳代的密度。

3、選擇優(yōu)質(zhì)的血清

血清中含有細(xì)胞生長(zhǎng)所必須的生長(zhǎng)因子，作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的附加物，血清的添加是十分重要的，因此，選擇優(yōu)質(zhì)的血清，是細(xì)胞養(yǎng)殖成功與否的關(guān)鍵！

4、及時(shí)傳代和更換培養(yǎng)液

在細(xì)胞增殖到一定的密度后，要及時(shí)傳代，根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)速度和密度，及時(shí)更換培養(yǎng)液。更換過勤，浪費(fèi)培養(yǎng)液，更換不夠及時(shí)，則細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)差，一般需隔天更換培養(yǎng)液，具體可根據(jù)所養(yǎng)細(xì)胞種類予以調(diào)整。

5、絕對(duì)的無菌意識(shí)

前面林林總總?cè)慷甲⒁夂昧耍绻麩o菌意識(shí)差，細(xì)胞中混入了微生物，則千里之堤潰于蟻穴，細(xì)菌的生長(zhǎng)速度和破壞力，將迅速占領(lǐng)培養(yǎng)皿，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，有些初學(xué)者會(huì)在培養(yǎng)液中加入1%的雙抗，但是，無菌意識(shí)不強(qiáng)，雙抗亦無法拯救你的細(xì)胞！

6、傾心的呵護(hù)，頻繁的觀察

做到以上幾點(diǎn)，就可以開始養(yǎng)你的細(xì)胞了，但是再次重申細(xì)胞嬌弱，在養(yǎng)細(xì)胞的過程中，難免會(huì)出現(xiàn)一些意想不到的問題，要想成功養(yǎng)好細(xì)胞，時(shí)時(shí)惦記它
，頻繁地觀察，初期一天觀察2次都不足為過，出現(xiàn)任何預(yù)料外的情況，及時(shí)處理，才能保障收獲一盤“漂亮”的細(xì)胞。