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帶您了解RT-PCR引物/探針

更新時間:2022-11-17  |  點擊率:1187

一、產(chǎn)品用途:

RT-PCR引物/探針(英文名:SARS-CoV-2 Confirm),用于定性檢測和分析新guan病毒RNA。它僅用于研究,不用于臨床診斷。

二、產(chǎn)品描述:

1.該產(chǎn)品包括三個小管:

①橙蓋:  Mix(凍干粉),1管。

此管為新guan病毒引物/探針,可特異性擴增新guan病毒的RdRp基因(即RNA依賴性RNA聚合酶基因),而其他冠狀病毒RNA不會被檢測到【1】【2】。(該引物/探針依據(jù)WHO診斷參考實驗室公布的新guan病毒引物/探針序列而設(shè)計【1】。更多詳情可訪問


如要檢測其他冠狀病毒,推薦MB公司提供的其他冠狀病毒引物/探針,品名:CoV Screen (without ConviFlex™ RT-Taq Mix),貨號:271-1100。

②綠蓋: Positive Control RNA(陽性對照RNA,凍干粉),1管。

此陽性對照RNA為一段合成的RNA序列(序列來自武漢的病毒株)。

③白蓋: PCR Grade Water(液體),1管。

2.使用前,①橙蓋和②綠蓋先用PCR級水(③白蓋)復溶,并分裝,避免反復凍融。

3.該引物/探針應與MB公司提供的【RNA病毒檢測試劑盒】(英文名:ConviFlex™RT-Taq Mix,

貨號192-0025/-0100/-0250)一起使用,用于新guan病毒RT-qPCR反應檢測。

4.檢測樣本需為抽提過的RNA樣本。

5.新guan病毒的靶基因RdRp是用FAM™通道檢測,擴增的人RNA酶P基因(過程對照)用ROX™通道檢測,用以評估樣本的制備質(zhì)量。

三、產(chǎn)品特點:

1.靶點特別。依據(jù)WHO國際標準,此引物探針為新guan病毒RdRp基因,而非市面上常見的ORF1ab和N基因或E基因。

2.陽性對照RNA為一段合成的RNA序列(序列來自武漢的病毒株)。

3.主要組分為凍干粉,4℃保存,儲存運輸方便,性能穩(wěn)定。

4.適用于科研中,各種來源的RNA樣本,包括拭子、活檢組織、哺乳動物細胞和細菌等。

四、需用戶自己準備的試劑耗材和儀器:

1.RNA病毒檢測試劑盒(RT-qPCR法)(英文名:ConviFlex™ RT-Taq Mix,貨號192-0025/-0100/-0250)

2.熒光定量PCR儀(qPCR儀)

3.無DNase和RNase的qPCR反應管

4.離心機

5.移液器及帶濾芯吸頭(不含DNase和RNase)

6.用戶自己提取的RNA或現(xiàn)成的RNA樣品。(抽提過程建議使用商品化的RNA提取試劑盒完成,如MB廠家的:

【病毒RNA提取試劑盒】(ExtractNow™ Virus RNA Kit,貨號611-1010/-1050/-1250)

或【病毒RNA拭子提取試劑盒】(ExtractNow™ Virus RNA Swab Kit,貨號611-2250)。

五、操作注意事項:

該引物/探針應僅由經(jīng)過培訓的實驗室人員使用。

始終穿上合適的防護服和戴一次性手套。

根據(jù)樣品類型,應謹慎處理所有樣品。請遵循WHO推薦的方法處理樣本。

該試劑盒不含有害物質(zhì)。 殘余物可以根據(jù)當?shù)胤ㄒ?guī)丟棄。

六、操作步驟:

步驟1. 試劑制備

①橙蓋Mix引物探針凍干粉,最大速離心5秒鐘,加入525lPCR級水(白蓋),室溫靜置5分鐘后,渦旋并離心5秒鐘,分裝,待用或-18℃保存。

②綠蓋Positive Control RNA陽性對照凍干粉,最大速離心5秒鐘,加入105lPCR級水(白蓋),室溫靜置5分鐘后,渦旋并離心5秒鐘,分裝,待用或-18℃保存。

步驟2. RT-qPCR引物/探針mix制備(20μl反應體積)

(1)1個反應需要加入:酶預混液 (自備的紅蓋預混液)10l ,

橙蓋(復溶的Mix引物/探針)5l

(紅蓋預混液 來自MB公司的【RNA病毒檢測試劑盒】(RT-qPCR法),

英文名:ConviFlexRT-Taq Mix, 貨號192-0025/-0100/-0250,需單獨購買)

(2)將以上引物/探針mix渦旋混勻,并離心5秒鐘。

(3)每個PCR管中加入15μl上述引物/探針mix和5μl樣本(抽提后的RNA),

或5μl RNA提取試劑盒中的洗脫緩沖液,作為陰性對照,或5μl PCR級水作為無模板對照,或5μl陽性對照RNA。

(4)緊扣PCR管,然后短暫離心。

(5)將PCR管放置qPCR儀上,緊上頂蓋。

步驟3. 設(shè)置qPCR程序

1個循環(huán): 55 ℃,10分鐘

1個循環(huán): 94 ℃,3 分鐘

45個循環(huán):94 ℃,15秒

58℃,30秒

步驟4. 啟動程序

七、使用注意事項:

1.使用前應認真閱讀說明書。

2.來自不同批次的試劑不能混合。

3.試劑盒內(nèi)的試劑應始終作為一個整體溶解分裝。

4.試劑盒應在效期內(nèi)使用。

5.每次PCR至少應設(shè)置一個陽性對照。每次PCR至少應設(shè)置一個陰性對照和/或一個無模板對照。如果實驗者自己抽提RNA,則可使用洗脫緩沖液作為陰性對照。對照必須與待測樣品的處理方式相同。您也可能需要其他實驗室提供的對照品,例如含高、中、低不同濃度的RNA樣品。使用對照,對于確認結(jié)果的可靠性或用于排除故障非常有意義。

6.建議在無RNA和DNA污染的條件下進行RT-PCR,以避免操作過程中DNA或非特異RNA的交叉污染。(MB公司推薦使用PCR污染祛除噴霧,英文名:PCR Clean™,貨號15-2025,預先清潔實驗環(huán)境。)

7.盡量減少RNA樣品的凍融次數(shù),同時避免RNA酶污染,以減少RNA降解的風險。(RNA降解會極大地限制了RT-qPCR反應的性能)。請確保高質(zhì)量的完整RNA用于檢測。

8.樣本制備過程中,注意避免其他DNA的污染,DNA的干擾也會降低qPCR的準確性。


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